DNA Dizileme Yöntemleri

Bu yazımızda DNA dizileme yöntemlerine ilişkin bir takım bilgiler paylaşmayı hedefliyoruz. DNA dizileme neden yapılır, hangi teknikler kullanılır, bizlere nasıl bir fayda sağlar gibi farklı alt başlıklarda kısaca konuyu toparlayacağız.

DNA dizilemeyi basitçe şu şekilde tanımlayabiliriz; bir DNA ipliğinde bulunan 4 farklı bazın (A,G,C,T), kesin ve doğru bir sırada dizilenmesine DNA dizilimi (DNA sequencing) denir.

Öncelikle insanlarda genetik yapıya  geri dönüş yapalım ve bazı sayısal bilgilerden söz edelim. Bildiğiniz gibi insanlar 23 çift kromozoma yani toplamda 46 kromozoma sahiptirler ve bu kromozomlar 50,000,000 dan 300,000,000 a kadar değişen baz çifti (A-T, G-C bazlarının karşılıklı ipliklerde kimyasal bağlarla -hidrojen bağı-  birleşerek oluşturdukları çift yapı) içerirler. Bu da yaklaşık olarak 3,2 milyar DNA bazına tekabül eder.  Sayıyı düşündüğümüz zaman oldukça uzun bir DNA zincirine sahip olduğumuz hakkında doğrudan çıkarım yapabiliriz. Peki bu uzunlukta bir DNA ipliğini baştan sona sürekliliğini bozmadan dizilemek mümkün müdür? Günümüzde geliştirilmiş olan tekniklere bakacak olursak, cevabımız hayır. DNA dizilimi yapılabilmesi için öncelikle bu uzun iplikli molekülü küçük parçalara bölmemiz gerekir. Daha sonra tüm kısa DNA parçalarının dizilemesi yapılır ve bilim insanları elde edilen verileri birleştirerek genetik bir harita oluşturur. Günümüzde bir insanın genomu -3,2 milyar baz- saatler içerisinde dizilenebilir.

SANGER Dizileme

Genom dizileme, mutasyonları direk olarak saptama adına önemli bir tekniktir. Tarihte geliştirilen ilk en doğru DNA dizileme tekniği Sanger dizilemedir. 1977 yılında Frederick Sanger tarafından geliştirilen bu metodun prensibi dideoksi nükleotitler ile zincir sonlandırmadır.

Dideoksi nükleotit, DNA zincirindeki şeker molekülünün 2’ ve 3’ karbon uçlarında hidroksil grubunu bulundurmayan nükleotitlerdir. Bu yapı taşları DNA zincirine eklendiği anda hidroksil grubu eksikliği nedeni ile DNA ipliğine başka bir nükleotit eklenemez ve zincir sonlanmış olur. Bu metodu uygulamak için dört farklı tüpe dizilemek istenilen alanı içeren DNA parçaları (PCR malzemeleri kullanılarak aynı sekans çoğaltılır ve birden fazla DNA parçası elde edilir), primer, nükleotitler, DNA polimeraz enzimi(yeni ipliği sentezlemek için) ve dideoksi nükleotitler eklenir. Her tüpe bir tür dideoksi nükleotit eklenir. Dizi okumasını sağlamak amacıyla dideoksi nükleotitlere işaretleme yapılır. Gelişen yöntemler ile floresan boyalı işaretlemeler yapılmaktadır. Elimizdeki tüm malzemeler dört farklı tüpte birleştirilir. Sonuç olarak farklı uzunluklarda parçalar elde edilir. Burada önemli olan nokta her tüpe yalnızca bir tür dideoksi nükleotit eklenmiş olmasıdır. Örneğin 1. tüpe ddATP, 2. tüpe ddGTP 3.tüpe ddCTP, 4.tüpe ddTTP eklenir. 

Bu dideoksi nükleotitler çoğaltılmış olan DNA molekülünü farklı uzunluklarda sonlandırır. Daha sonra dizilemeyi yapmak amacıyla kapiler jel elektroforezinde DNA parçaları yürütülür. Kısa parçalar uzun parçalara göre hızlı bir şekilde hareket ederler. Lazer ışınları ile gerçekleştirilen yansıma kromatogram ile DNA dizisinin okunmasında görev alır.  Jel sonuçlarına göre aşağıdan başlayarak yukarı doğru lazer ile işaretlenmiş parçalar saptanır ve elde edilen veriler ile istediğimiz DNA sekansını dizilemeyi başarıyla tamamlamış oluruz.

Sanger dizileme yönteminin birçok avantajı ve dezavantajı bulunmaktadır. Avantajlarından bahsedecek olursak; Eğer yalnızca belli spesifik bir gen dizilemesine bakılmak isteniyorsa, gen dizisindeki kısa bir bölgeye bakılmak isteniyorsa, bilinen bir mutasyon için dizileme isteniyorsa, tüm genomu dizilemek yerine Sanger metodunu kullanmak daha hızlı ve ucuz bir yöntem olabilir. Hata oranı en düşük olan dizileme yöntemidir. Ancak dezavantajlarına değinmek gerekirse; tüm bir genom dizilenmek istendiğinde oldukça pahalı bir yöntemdir. Her bir reaksiyonda 250-500 baz çifti dizilemesi yapılabilir. Dizilerin kısa olması sebebiyle çok sayıda DNA parçası çoğaltımı gerektirir bu da maliyeti yükseltir. Geliştirilmiş olan diğer yöntemlere göre daha yavaştır. İnsan genom projesinde de genom dizilimi Sanger metodu ile yapılmıştır ve 13 yıl sürmüştür.

Yeni Nesil Dizileme Yöntemleri

Yeni nesil dizileme yöntemi ilk kez 2005 yılında 454 Life Sciences adlı şirket tarafından geliştirilmiştir.  Yeni nesil dizileme, kişiye özel tıp, genetik hastalıkları tespit ve aynı anda birden fazla kişinin genom dizilemesini yapmasından dolayı birçok avantaja sahiptir. Aynı anda milyonlarca kısa DNA dizilemesinin yapılmasını sağlar. Sanger metodu daha az sayıda kısa DNA dizilemesi yaptığından dolayı ve uzun zaman aldığı için yeni nesil dizileme yöntemleri geliştirilmiştir. İlk yeni nesil dizileme metodu 454 Roche Pyrosequencing (pirosekanslama) dır.

454 Roche Dizileme

454 dizileme teknolojisinde ilk aşama bir DNA kütüphanesi ve dizilenecek olan DNA örneklerini oluşturmakla başlar. Roche 454 dizilemesinin temel prensibi pirosekanslamaya dayanır.

Pirosekanslama ile dizilemedeki temel prensip sentezleyerek dizileme yapılmasıdır. Pirosekanslamada dizileme reaksiyonu DNA polimerazın yeni bir zincir sentezlemesi ile farklı enzimlerin de yardımıyla her nükleotit eklendiğinde pirofosfatın ayrılması ile gerçekleşir. Bu ayrılan pirofosfat daha sonra enzimlerle kimyasal reaksiyona girerek ışıma yapan bir moleküle dönüşür. Işık kamera yardımıyla detekte edildikten sonra dizileme yapılır.

Pirosekanslamada ilk adım DNA çift sarmalının denaturasyon yapılarak tek zincir haline getirilmesiyle başlar. DNA polimeraz yeni ipliğin sentezlenmesini gerçekleştirir. Her nükleotit zincire eklendiğinde, pirofosfat ayrılması gerçekleşir. Ayrılan pirofosfat ve adenozin 5’ fosfosulfat(APS)’ ın sülfürilaz enzimi ile kataliz edilmezinden sonra ATP üretimi gerçekleştirilir. Daha sonra reaksiyona lüsiferaz enzimi eklenir. Lüsiferaz enzimi ATP yi kullanarak oksidasyon sonucunda lüsiferin üretir. Lüsiferin bileşiği ışık yayan bir maddedir. Yayılan ışık kızıl ötesi kamera yardımıyla kaydedilir ve peak halinde görüntülenebilir. Görüntülenen peaklerin yüksekliği eklenilen nükleotit sayısına göre belirlenir. Her peak eklenmiş olan bir nükleotidi temsil eder. Bunun sonucunda tüm genom dizileme okuması gerçekleştirilmiş olur. DNA polimeraz ile iplik sentezlenmesi sırasında herhangi bir nükleotidin zincire bağlanmaması durumunda apiraz isimli enzim devreye girer ve bağlanmamış olan nükleotidin indirgenmesini sağlar. Bu şekilde bu bağlanmamış olan nükleotitler ışıma yapmaz ve yanlış dizileme önlenmiş olur.

DNA kütüphanesini oluştururken ilk aşama DNA molekülünü parçalara bölmekle başlar. DNA 300-800 baz çifti olacak şekilde parçalanır. DNA parçalaması işlemi nebülizasyon ile yapılabilir. Bu yöntemde sıkıştırılmış hava ile DNA küçük boşluklara doğru itilir. (DNA parçalaması gerçekleştirilmiş olur). Nebülizasyondan sonra parçaların uçlarına A ve B olmak üzere iki farklı adaptörler bağlanır. A adaptörü dizilenecek primer için bağlanma bölgesi içerir. B adaptörü ise biyotin içeren bir yapıdadır ve streptavidinli boncuklara bağlanmayı sağlar. Boncuğa bağlanan DNA parçaları denaturasyon ile tek zincirli yapıya dönüştürülür. Biyotin olmayan zincirler boncuktan kopar. Böylelikle tek zincirli DNA kütüphanesi sağlanmış olur. Daha sonra her boncuğa bir DNA parçası bağlamak amacıyla B adaptörünü tamamlayıcı olan oligonükleotit kaplı boncuklar ile tek zincir bağlanmış olan boncuklar karıştırılır. Sonuç olarak her boncukta bir DNA parçası elde edilmiş olur. DNA molekülünü kopyalamak için su ve yağ emülsiyonu ile tüm boncuklar karıştırılır. Emülsiyon aynı zamanda PCR ı sağlayan maddeleri de içerir. Böylelikle her boncuktaki DNA kopyalanmış olur. Yağ karışımdan çıkarıldıktan sonra tüm boncuklar picotiter denilen boşlukları olan bir tabağa eklenir. Her boncuk bir boşluğa girer. Aynı zamanda her boncuğa pirosekanslamada kullanılan enzimler eklenir. Pirosekanslama sonrasında ise ışımalar kızılötesi kameralarla görüntülenir. 

Avantajları;  Pirosekanslama, Sanger metoduna göre daha kısa sürede daha uzun DNA dizilemesi yapabilir.  Jel elektroforezi gerektirmez. Bu nedenle daha ucuz bir yöntemdir. Sanger metodunun kullanıldığı insan genom projesi 13 yılda tamamlanmış iken, James Watson’ un genomunu dizilemek için 454 dizilemenin kullanıldığı çalışma iki ay içerisinde bitmiştir.

Dezavantajları; Homopolimer tekrarlarda hata oranı yüksek olabilmektedir. Homopolimerlerdeki tek bazlık ekleme veya çıkarmalar saptanamayabilir.

DNA dizileme tekniklerine bir sonraki yazımızda devam edeceğiz. Metotların daha iyi anlaşılması için tavsiyemiz aşağıda bulunan linklerdeki videolara göz atmanızdır.

Sanger dizileme: https://www.youtube.com/watch?v=FvHRio1yyhQ

454 Pirosekanslama: https://www.youtube.com/watch?v=nFfgWGFe0aA

             https://www.youtube.com/watch?v=KzdWZ5ryBlA

Kaynakça

•  Miodrag Guzvic, THE HISTORY OF DNA SEQUENCING, University of Regensburg, Regensburg, Germany ,2013
• Wei Chen, Sequencing technology-Past, Present and Future, Berlin Institute for Medical Systems Biology Max-Delbrueck-Center for Molecular Medicine,2013
• Anjana Munshi, DNA SEQUENCING –METHODS AND APPLICATIONS, Intech, 2012
• T.A. BROWN, GENE CLONING AND DNA ANALYSIS An Introduction, Faculty of Life Sciences University of Manchester Manchester, 6th edition, 2010