DNA Dizileme Yöntemleri - 2

DNA Dizileme Yöntemleri-2

Bu yazımızda 2006 yılından itibaren geliştirilmekte olan farklı DNA dizileme yöntemlerine uzun bir aradan sonra devam ediyoruz.

İlk yeni nesil dizileme, 454 Pyrosequencing 2005 yılında Roche firması tarafından geliştirildikten sonra, farklı firmalar daha az maliyette daha iyi bir sonuca ulaşmak amacıyla yeni nesil dizileme metotlarını geliştirmekte rekabet içine girdiler. Firmalar tarafında hedeflenen dizileme maliyeti 1000$ olarak belirlendi. Böylelikle dizileme metotlarının dünya çapında daha çok kullanılması amaçlandı.

Illumina Genome Analyzer

Illumina 1998 yılında Amerika’da kurulmuş olan, biyolojik verilerin analizi, genetik bilginin işlenmesi gibi birçok alanda ürün geliştiren ve pazarlayan bir firmadır.  Illumina 2006 yılında geliştirdiği Genome Analyzer 2006 yılında Genome Analyzer isimli ilk SOLEXA dizileme metodunu geliştirdi. Bu cihaz önceki yöntemlere göre popülaritesi çok yüksek olan bir cihazdır çünkü bir çalıştırmada 1 gigabazlık dizileme yapabilmektedir. (1 kb = 1000 bp, 1000 kilobasepair  =  0.001 gigabasepair)

Illumina dizilemede, pirosekanslamada olduğu gibi ilk olarak bir DNA kütüphanesi oluşturulur ve bu yöntem de sentezleme yoluyla dizilemeye dayanır. Kütüphane oluşturulurken DNA parçalarının iki ucuna adaptörler eklenir. Flow cell, dizilemenin gerçekleşmesi için gereken kimyasal olayların meydana geldiği küçük kanallar içeren cam bir tabakadır. Adaptörlerden biri dizilemenin bağlanma noktasını sağlar, diğeri ise flow cell e tamamlayıcı olan ve flow cell e bağlanmayı sağlayan bölgeyi içerir. Denaturasyon ile DNA parçaları tek zincirli yapı haline getirilir. DNA parçaları flow cell e aktarılır. Flow cell in yüzeyi adaptörlere tamamlayıcı olan primerler içerir. İki farklı adaptör için de complementary(tamamlayıcı) primer vardır. Böylelikle DNA parçaları flow cell e kolaylıkla bağlanmış olur. DNA polimeraz enzimi DNA parçasının flow cell üzerindeki primere bağlanmasıyla birlikte iplik sentezini geliştirir. Daha sonra denaturasyon ile orijinal DNA parçası flow cell den ayrılır ve aynı diziye sahip DNA polimeraz ile sentezlenen iplik flow cell de bağlı bir şekilde bırakılır. Bu ipliğin çoğalması için köprü amplifikasyonu denilen yöntem kullanılır. DNA parçasına eklenen iki adaptörlerden birinin flow cell e bağlı olması nedeniyle diğer açıkta bulunan ucu yine flow cell üzerindeki kendine tamamlayıcı (complementary) olan primere bağlanır ve bir köprü oluşmuş olur. Bu aşamada DNA polimeraz tekrardan devreye girer ve bağlanılan primerden DNA ipliğini sentezlemeye başlar. Böylelikle DNA parçasının birden fazla kopyası yapılmış olur. Bu süreç böylelikle devam eder. Ters diziyi içeren iplikler flow cell den yıkanarak ayrılır böylelikle yalnızca dizilenecek olan DNA parçalarını tamamlayıcı iplikler kalmış olur. Tekrardan köprü amplifikasyonu olmaması için 3’ OH sonları bloke edilir. Daha sonra dört faklı nükleotid floresan boyalarla işaretlendikten sonra iplikte bağlanmaları gereken yerlere bağlanırlar. Işımalar kaydedilir ve dizileme gerçekleşmiş olur. Aynı adımlar ters diziyi içeren iplikleri okumak için de yapılır.

SOLID (Sequencing by Oligo Ligation Detection)

Solid dizileme ABI (Applied Biosystems) tarafından 2007 yılının sonlarına doğru piyasaya sürülmüş olan dizileme yöntemidir. Solid dizileme metodu; tüm genom dizileme, hedeflenmiş bölge dizileme, gen ifadelerinin analizi, küçük RNA analizlerinde ve ChIP seq dizilemelerinde kullanılabilmektedir.

Diğer yöntemlerde kullanılan sentezleme yerine Solid dizilemede ligasyon kullanılır. Ligasyon, bir enzim yardımıyla iki DNA parçasının birbirine bağlanmasına denir.  Bu metotta da öncelikle örneklerin yer aldığı bir DNA kütüphanesi yapılır.  454 dizilemede olduğu gibi iki adet adaptör DNA parçalarının ucuna bağlanır. DNA parçaları boncuklara bağlanarak PCR yapılır. DNA parçaları taşıyan boncuklar cam bir lam a yerleştirilir. Bu boncuklar dizileme primeri, ligaz enzimi ve probelar ile birleştirilir. Sistemde 16 adet oktamer probe bulunmaktadır. Probelar dört faklı baz için farklı farklı floresanlı radyoaktif boyalar ile işaretlidirler. İkili bazın belirli kombinasyonunu içeren probelar aynı renk ile işaretlenir. Örneğin AC ve CA aynı renk boya ile işaretlidir. Primer DNA parçasına bağlanır. Boncukta bulunan DNA parçası ile tamamlayıcı probe ligaz enzimi yardımıyla yapıştırılır. Bağlanma sonucunda gerçekleşen ışıma kaydedilir ve yeni probe bağlandığında bir önceki bağlanmış olan probedaki 3 baz ve boyalı kısım kesilir ve ışıma yapmaz. Bu kesilme 3 adet 5’ fosfat grubunu açık bırakır böylece yeni bir probe diziye bağlanabilir. Bu döngü yaklaşık yedi kez tekrarlanır.  Daha sonra sentezlenmiş olan iplik ayrılır ve yeni bir primer tekrardan bağlanılır. Her tekrarda primer bir baz atlayacak şekilde bağlanır. Bu döngü ise 5 kez tekrarlanır. Böylelikle her baz için çift ölçüm yapılmış olur. Solid yönteminde kullanılan ikili baz ligasyonu ile doğruluk oranı yüksek seviyeye ulaşır ve güvenilirliği artar. Ayrıca solid dizilemedeki iki adet birbirinden bağımsız bulunan flow cell ile iki farklı deney aynı anda yapılabilir ve böylelikle verim arttırılmış olur.

Ion Torrent Dizileme

Life Technologies firması 2011 yılında tüm genom analizini 1000$ kadar düşük bir maliyete indirecek olan ion torrent dizilemesini geliştirdi. Ion torrent teknolojisini özel yapan şey DNA molekülündeki kimyasal bilgiyi yarı iletken bir çip üzerinde dijital bilgiye çevirmesidir.

Diğer yöntemlerde de olduğu gibi DNA milyonlarca parçaya ayrılır ve tek zincir haline getirilir. Her parça bir boncuğa bağlanır ve boncukta kopyalanarak çoğalır. Böylelikle milyonlarca DNA parçası milyonlarca boncuğa bağlanır ve DNA kütüphanesi sağlanmış olur. Bu boncuklar yarı iletken olan özel çip üzerine yerleştirilir. Daha sonra çip 4 farklı nükleotidden biri ile doldurulur. Bir nükleotid tek iplikli DNA da yerine bağlandığı zaman bir hidrojen iyonu dışarıya verilir. Ion torrent teknolojisi dizilemeyi bu hidrojen salınımının ölçümü ile yapar. Hidrojen salınımı sayısı her boşlukta miktara göre boşluğun pH ını değiştirir. Çipteki boşlukların altında bulunan iyon hassasiyetli tabaka ph daki değişimi ölçer ve voltaja çevirir. Ölçülen voltaj kaydedilir. Bu döngü her 15 saniyede bir tüm nükleotidler için ayrı ayrı olacak şekilde gerçekleştirilir. Eğer aynı nükleotid peş peşe bağlanmış ise voltaj iki katına çıkar ve böylelikle aynı bazın iki kez peş peşe bağlandığı anlaşılabilir. Ion torrent teknolojisinin dezavantajı homopolimer bölgeleri dizilemede hata yapma olasılığının yüksek olmasıdır. En büyük avantajı ise çok kısa sürede dizileme yapması ve ucuz olmasıdır.

PacBio SMRT Dizileme (Single Molecule Real Time Sequencing)

2011 yılında Pacific Biosciences şirketi SMRT adı verilen DNA dizileme yöntemini geliştirdi.  Bu sistemdeki temel prensip DNA polimeraz enziminin yeni iplik sentezlemesidir. PacBio bu prensipten yola çıkarak iki özel DNA dizileme teknolojisi geliştirdi. Bunlardan ilki phospho-linked nükleotidlerin kullanılarak ışıma yapmasıyladır. Normalde ışıma yapan işaretlemeler nükleotidde baza bağlanırken burada fosfat grubunun sonuna bağlı işaretlemeler kullanılmaktadır. Her 4 nükleotid için farklı boyalar kullanılmıştır. DNA polimeraz yeni zinciri sentezlerken nükleotidin bağlanması sırasında ışıma yapan işaretleyiciyi keser ve bu kesilen ışıma anlık olarak kaydedilir. İşaretli kısmın kesilmesi DNA çift sarmalının yapısını kesinlikle bozmaz. Bu yöntemle hızlı, güvenilir ve uzun okuma uzunluğu sağlanır.

İkinci geliştirilen özel teknoloji ise nanofotonik görüntüleme ile yapılan dizilemedir. Nanofotonik görüntüleme yapılan bölge zero mode waveguide(ZMW) olarak adlandırılır. Flow cell gibi SMRT sistemi de özel bir cell e sahiptir ve binlerce ZMW bölmesi içerir.  ZMW bölmesi silindir şeklinde, metal, 70 nanometre genişliğinde olan ve çok küçük hacimlerin ölçülmesini sağlayan bir bölmedir. Sadece 20 zeptolitre(20*10^(-21))lik bir hacmi ölçme kapasitesi ile dünyanın en küçük hacim saptama özelliğine sahiptir. İşaretli nükleotidler ZMW bölmelerinden mikrosaniyede geçerler. DNA polimerazın sentezlemeyi gerçekleştirmesi ile ışıma anlık olarak hassas bir detektör ile saptanarak kaydedilir. Tüm bu işlemler çok hızlı bir şekilde gerçekleşmekte ve uzun okuma uzunluğunu sahip olmakla birçok avantaj sağlamaktadır.

Nanopore Dizileme

Oxford Technologies adlı şirket tarafından 2015 yılında geliştirilmiş olan bir yöntemdir. DNA, RNA ve protein dizilemesinde kullanılır. Bu sistemdeki temel molekül nanopore adı verilen çapı nano ölçüde boru şeklinde boşluğa sahip olan proteindir.

Nanoporelar normalde bağlandıkları yüzeyde boşluk açarlar. Bu sistemde nanopore proteini elektriğe dayanıklı bir tabaka üzerine yerleştirilir. Bu tabaka sentetik polimerlerden yapılır. Daha sonra iyonik bir akımın nanoporedan geçmesi ile voltaj oluşur. Akımın ölçülmesi sayesinde moleküllerin ne olduğu hakkında bilgi elde edilir. DNA dizilemede tek zincirli DNA nanoporedan geçerken dört nükleotidin de farklı şekillerde olması sebebiyle farklı akımlar oluşur. DNA tek zincirinin nanoporedan geçmesi enzim yardımı ile yapılır. Enzim DNA çift sarmalı ayırır ve tek ipliği birer baz geçecek şekilde nanoporedan içeriye doğru iter. Bu yöntemin avantajı tek bir molekülün dizilemesini gerçekleştirmesidir.

Aşağıda bulunan linklerdeki videolar ile dizileme metotlarını daha iyi inceleyebilirsiniz.

Illumina: https://www.youtube.com/watch?v=fCd6B5HRaZ8

SOLID: https://www.youtube.com/watch?v=nlvyF8bFDwM

Ion Torrent Sequencing: https://www.youtube.com/watch?v=WYBzbxIfuKs

PacBio SMRT: https://www.youtube.com/watch?v=NHCJ8PtYCFc

Oxford Nanopore Sequencing: https://www.youtube.com/watch?v=GUb1TZvMWsw